Condrogeneza și regenerarea cartilajului

Materiale biomedicale Abstract Osteoartrita OA este o cauză frecventă a durerii și dizabilității și este adesea asociată cu degenerarea cartilajului articular. Leziunile la suprafața articulară, despre care se crede că progresează până la OA, au potențialul de a fi reparate folosind strategii de inginerie tisulară; cu toate acestea, rămâne dificilă instruirea diferențierii celulare în cadrul unei schele pentru a produce țesut cu proprietăți structurale, chimice și mecanice adecvate.

Ne-am propus să abordăm acest lucru, determinând condrogeneza și regenerarea cartilajului progenitoare să adopte un fenotip condrogenic, prin adaptarea compoziției schelei și a proprietăților fizice. Schelele monomerice de colagen de tip I și de tip II, care evită imunogenitatea potențială asociată cu colagenii fibrilari, au fost fabricate cu și fără sulfat de condroitină CS și capacitatea lor de a stimula diferențierea condrogenică a celulelor stem mezenchimale derivate din măduva osoasă umană.

TESUTUL CARTILAGINOS-1

Analizele imunohistochimice au arătat că celulele au produs abundent colagen de tip II pe schele de tip II și colagen de tip I pe schele de tip I. Analizele de expresie genică au indicat faptul că adăugarea CS - care a fost eliberată de eșafodele rapid - expresia regulată semnificativ a colagenului de tip II, în comparație cu schele de tip I și pure de tip II.

Concluzionăm că colagenul de tip II și CS poate fi utilizat pentru a promova un fenotip mai condrogenic în absența factorilor de creștere, care ar putea oferi o eventuală terapie pentru prevenirea OA. Introducere Osteoartrita OA este o cauză majoră a dizabilității la populația adultă 1. Se consideră că leziunile traumatice la suprafața cartilajului progresează până la OA 2.

Prin urmare, tratamentul precoce poate preveni progresia OA și poate amâna nevoia de înlocuire totală a articulațiilor. Cartilajul are o capacitate limitată de auto-vindecare 3, iar opțiunile curente de tratament, care includ stimularea măduvei microfracturămozaicoplastia și implantarea de condrocite autologe pot duce adesea la formarea fibrocartilajului inferior în locul cartilajului hialin și poate fi asociată cu site-ul donatorului. Repararea cartilajelor folosind strategii de inginerie a țesuturilor TE poate fi o alternativă eficientă 5, 6, 7, 8, 9.

Abordările TE pentru repararea cartilajelor asigură un microambient tridimensional pentru atașarea, creșterea și diferențierea celulelor, ceea ce poate reduce la minimum dediferențierea condrocitelor care apare în culturile bidimensionale Cu toate acestea, schela ideală cu proprietăți structurale, chimice și mecanice care pot direcționa condrogeneza și regenerarea cartilajului adecvată a celulelor progenitoare și formarea cartilajului rămâne evazivă.

Celulele stromale ale măduvei adesea numite celule stem mezenchimale, MSCpot fi derivate din măduva osoasă și au capacitatea de a se diferenția de condrocite de exemplu, ref. S-a dovedit a fi deosebit de importantă în compoziția matricei extracelulare ECM pe care cresc celulele stem 13, 14, Adică, s-a demonstrat că matricele specifice unui anumit țesut determină diferențierea celulelor stem în aceeași linie. Aceasta a fost una dintre forțele motrice ale dezvoltării matricilor decelularizate ca schele pentru TE.

De exemplu, s-a demonstrat că MSC-urile crescute pe ECM os decelularizat, diferențiat de osteoblaste fără adăugarea de factori chimici de exemplu, dexametazona Prin urmare, o abordare potențial promițătoare pentru cartilaj TE este imitarea compoziției și structurii ECM native pentru fabricarea unei schele adecvate.

Cartilajul articular este format în principal din colagen de tip II și sulfat de condrogeneza și regenerarea cartilajului glicozaminoglican CS 3.

Diferența cheie - Chondroblaste vs condrocite

Un eșafod care imită această compoziție poate conduce în mod eficient diferențierea MSC-urilor și poate fi potrivit pentru regenerarea cartilajului. Colagenii pentru fabricarea eșafodelor TE sunt adesea extrași din țesuturile bogate în tipul de colagen dorit. Formele monomerice de colagen pot fi lipsite de telopeptide atelocollagen sau au telopeptidele intacte tropocollagenîn timp ce forma polimerică este insolubilă și este compusă din tropocollagen natural reticulat Majoritatea eșafodelor colagene 18, 19, 20 pentru TE sunt fabricate folosind colagen polimeric datorită ușurinței și costului scăzut al extracției sale.

Cu toate acestea, prezența legăturilor încrucișate native în colagenul polimeric poate induce variabilitatea de la lot la lot, reducând fiabilitatea produsului final.

Mai mult, majoritatea colagenilor sunt extrași din țesuturile animale, ceea ce poate introduce probleme cu imunogenitatea Atelocollagenii lipsiți de astfel de determinanți imunogenici și legăturile încrucișate native pot fi o formă preferată de colagen pentru schele TE. Cu toate acestea, atelocollagenii au fost folosiți doar în câteva studii 22, 23, 24, astfel încât potrivirea lor pentru TE este relativ inexplorată.

Atelocollagen se poate autoasambla in vitrounde formarea fibrilului și diametrul fibrilelor vor depinde parțial de tipul de colagen 25, de metoda de extracție 26 și de condițiile precise de prelucrare Pe măsură ce fibrilele se formează, greutatea moleculară a colagenului crește, ceea ce poate afecta vâscozitatea soluției de colagen ulterioare și, astfel, stabilitatea mecanică și proprietățile de degradare a schelei finale.

Mai mult, astfel de modificări pot afecta, de asemenea, nanotopografia condrogeneza și regenerarea cartilajului 28 conferită prin bandă d în timpul fibrilogenezeiprecum și proprietățile sale microstructurale 29, inclusiv dimensiunea porilor 30, forma porilor 31 și rezistența la compresiune 32, 33, care pot influența toate celulele. CS este un carbohidrat polimeric cu unități sulfatate, încărcate negativ, care repetă unități de dizaharid. CS este non-imunogen și poate afecta comportamente celulare, inclusiv aderența, migrarea și diferențierea Incorporarea CS în fibrilele de colagen stimulează proliferarea condrocitelor in vitro 35, creșterea creșterii celulare și reducerea răspunsului corpului străin in vivo S-au efectuat o serie de studii pe schele de colagen de tip I și II în care CS a fost încorporat fie prin co-precipitare 18, 19, 37, 38, fie prin atașarea covalentă a CS la colagenul 35, 39, Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă, prin adaptarea compoziției schelei și a proprietăților fizice, am putea promova celulele progenitoare pentru a adopta mai multe fenotipuri condrogenice.

Am produs anterior și a caracterizat schele monomerice de tip II de colagen — CS 17 și am raportat despre microstructura și proprietățile mecanice ale acestora. Aici, am produs, de asemenea, schele de tip I de atelocollagen și am investigat efectul tipului de colagen și încorporarea CS asupra comportamentului celular și a potențialului acestora de a direcționa diferențierea celulelor stem în absența inducției chimice sau a factorilor de creștere Fig.

Arătăm că scheletele de colagen afibrilare și fibrilară reconstituite de tip II care conțin CS susțin viabilitatea celulară și diferențierea condrogenică directă condrogeneza și regenerarea cartilajului celulelor stem mezenchimale ale măduvei umane hBMMSCs.

Colagenii de tip I și de tip II au fost prelucrați pentru a produce schele afibrilare și reconstituite fibrilare încorporând CS. Schelele au fost însămânțate cu hBMMSC și au fost examinate interacțiunile celulelor-schele, inclusiv viabilitatea celulară, morfologia și activitatea metabolică.

Diferențierea celulară a fost studiată folosind imunostanțarea și expresia genelor. Imagine completă Rezultate si discutii Caracterizarea schelei și evaluarea microstructurala Am fabricat schele de colagen afibrillar tip I 1af și afibrillar și reconstituite schele de colagen tip II respectiv 2af și 2rf cu și fără CS tabelul 1.

Comparând caracteristicile schelelor 1af cu cele ale schelei noastre de tip II caracterizate anterior tabelul 2 - unele date reproduse cu permisiunea pentru comparația 17multe proprietăți, inclusiv modulul compresiv al schelei 1af au fost comparabile cu cele ale schelei 2af.

Rigiditatea schelei poate afecta soarta celulelor stem 32 și s-a dovedit că porozitatea reglează comportamentele celulare 42, inclusiv aderența și încărcarea. Porozitatea este esențială pentru difuzarea nutrienților și a gazelor în celule, precum și pentru eliminarea deșeurilor metabolice.

TESUTUL CARTILAGINOS-1

Tabel cu dimensiuni complete Tabel cu dimensiuni complete Imaginile cu microscopie electronică de scanare SEM fig. Dimensiunea porilor de eșafodaj poate afecta atașarea celulară, morfologia și diferențierea Forma porilor, prezentată aici ca un coeficient izoperimetric al circularității Q Tabelul 2poate influența soarta celulară.

Adică, celulele progenitoare s-au dovedit a fi direcționate către o linie specifică prin controlul artificial al formei lor. De exemplu, BMMSCs cu o formă de celulă mai rotunjită au fost asociate cu exprimarea mai mare a markerilor condrogeni 43, Prin urmare, schele cu forme de pori mai circulare ar putea fi benefice pentru diferențierea condrogenică.

Mărimile axelor porilor eliptici au fost cuantificate pentru a determina proporția potrivită pentru a susține formarea țesutului cartilaj. Pentru regenerarea cartilajului, porii de 50 - μm sunt de obicei considerați potriviți pentru stimularea diferențierii adecvate și formarea țesuturilor 45, Pe baza acestui rezultat, aceste două grupuri plus 2af au fost alese pentru analize celulare suplimentare.

Microstructura schelei și interacțiunile celulă-schele: a Micrografii SEM care prezintă structura poroasă și caracteristicile interne ale schelelor de colagen. Săgețile roșii indică porii secundari, care sunt perforații în pereții porilor.

Celulele vii sunt verzi și celulele moarte sunt roșii.

Imagine completă Viabilitatea celulară și activitatea metabolică pe schele Am emis ipoteza că o condrogeneza și regenerarea cartilajului a compoziției biologice și a proprietăților fizice ale schelelor ar conduce la diferențierea hBMMSCs în absența stimulilor chimici suplimentari.

Toate schele au permis atașarea și viabilitatea celulelor pe parcursul a 28 de zile. Colorarea imunofluorescenței pentru actină a arătat un citoschelet bine dezvoltat, care sugerează că celulele au fost capabile să adopte morfologii răspândite pe schele Fig. Activitatea AlamarBlue, o măsură a activității metabolice celulare, a fost cuantificată în ziua 1 ca o indicație a atașării celulare. Se crede că este parțial legat de numărul de site-uri active de legare a celulelor pe fiecare; în colagenul de tip I, lanțul α1 I al triplei helix este mai activ decât lanțul α1 II în colagen de tip II, deoarece conține reziduuri peptidice 47 mai active.

Sari la navigare Sari la căutare Osificarea si osteogeneza sunt procese biologice diferite. Osificarea este procesul prin care organismul uman construieste tesut osos.

Proliferarea celulelor, modificarea dimensiunii schelei și eliberarea CS: a Activitatea metabolică a celulelor pe schele determinată prin măsurarea activității alamarBlue unitate arbitrară: intensitate fluorescentă. În timp ce dimensiunea eșafodelor de tip I a scăzut în prezența celulelor, producția de matrice presupuse a mediat o creștere a mărimii schelelor de tip II. Imagine completă Modificări ale proprietăților fizice ale schelei și analize ale sintezei matricei Toate schele au prezentat un anumit grad de contracție atunci când au fost plasate în mediul de cultură celulară Fig.

Pentru a evalua modificările dimensiunii eșafodului cu cultură și pentru a determina contribuțiile mediate de celule și mediate de soluție, mărimile lor au fost monitorizate pe parcursul a 28 de zile.

Contracția scheletului de colagen este recunoscută pe scară largă și poate fi problematică pentru TE. Nu numai că poate denatura forma și dimensiunile atunci când sunt plasate într-un loc medicament complex de glucosamină condroitină, dar poate duce la constricția porilor care afectează proprietățile difuzive și migrația celulară Interesant este că, după 28 de zile, măsurătorile de mărime mediate de celule, pe care le-am definit ca fiind modificări în diametrul eșafodului măsurate în schele care conțin celule, în comparație cu controalele fără celule, au relevat o creștere a dimensiunilor schelei de tip II care ar fi putut rezulta din medierea celulelor depunerea matricei Fig.

Este posibil ca expunerea persistentă a CS încărcat negativ la aminoacizii încărcați pozitiv în mediile α-MEM să le fi atras departe de colagen, provocând dispersia acestuia condrogeneza și regenerarea cartilajului mediu.

Într-adevăr, contracția inițială pronunțată a schele care conțin CS poate fi rezultat, cel puțin parțial, din această pierdere a CS. Examinarea histologică a eșafodelor după 28 de zile în cultură Fig.

Picosirius Colorația roșie, un indicator al prezenței colagenilor, a arătat mai multă colorare în schele de tip II în comparație cu tipul I, prin urmare, speculăm că un eșantion mai mare de degradare a colagenului a avut loc în schele de tip I comparativ cu schele de tip II sau celule secretate matrice mai colagenoasă când este însămânțată pe schele condrogeneza și regenerarea cartilajului tip II. Acest lucru este în conformitate cu analizele de dimensiuni ale schelei, care au arătat o creștere a diametrului schelei pentru schele de tip II în perioada de cultură de 28 de condrogeneza și regenerarea cartilajului.

Colorarea roșie Alizarin a fost pozitivă pentru depunerea de calciu pe schele 1af și 2af, dar numai colorația de fundal a fost evidentă pe schele de tip II care conține CS, ceea ce sugerează că lipsa CS poate oferi un mediu adecvat osteogenezei.

(PDF) Os Mus | Mariana Nedelea - studentscareer.ro

Colorarea pozitivă a calciului ar putea fi, de asemenea, mediată de diferențierea hipertrofică a hBMMSC. Pentru a exclude această posibilitate, ar fi necesară o colorare suplimentară pentru markerii diferențierii hipertrofice, cum ar fi colagenul de tip X.

În mod alternativ, pe schele de tip I, am detectat colorarea pentru colagenul de tip I pe întreg teritoriul uman, cu o colorație mică sau deloc pentru colagenul II. De asemenea, am observat colorații ample pentru Safranin-O, un indicator indirect al depunerii de proteoglican, pe schele de tip II, dar foarte mică colorare pe schele de tip I Fig.

Aceste rezultate sugerează că compoziția schelei în sine a afectat secreția ECM. Acest lucru a fost surprinzător, având în vedere colorarea pozitivă a colagenului de tip II în unele formulări de schele. Cu toate acestea, întrucât ambele SOX9 și RUNX2 sunt markeri timpurii 50 pentru condro și respectiv osteogeneză, este posibil să fi fost reglați și apoi reveniți la niveluri bazale până în ziua Varghese și colab.

Mai mult, un procent mai mare de pori în schele care conțin CS în comparație cu cele fără CS și schele de tip I au dimensiuni adecvate 50 - μm pentru condrogeneză.

În matrice au loc fenomene de resorbţie, rezultând septuri subţiri, intercelulare. La periferie se formeauă os membranos. Aspect dorsal; B.

Prin urmare, este posibil ca diferențierea condrogenă să fie determinată de o combinație de tip colagen tip IIprezența CS bioactiv și caracteristicile fizice ale schelei de colagen deși prezența CS a părut cel mai decisiv factor. Pe scurt, tipul de colagen extrem de purificat condrogeneza și regenerarea cartilajului tip II ar fi putut oferi o bază adecvată pentru adăugarea de factori specifici care să favorizeze diferențierea. Superioritatea colagenului de tip II pentru condrogeneză poate avea implicații în proiectarea unei schele pentru repararea cartilajelor, fără a fi necesară o livrare susținută a factorilor de creștere.

Diferența dintre condroblaste și condrocite Postat pe Diferența cheie - Chondroblaste vs condrocite Cartilajul este un țesut conjunctiv specializat care se găsește în multe locuri ale corpului.

Imagine completă metode Fabricarea condrogeneza și regenerarea cartilajului Colagenul de tip II a fost extras din cartilajul articular bovin fetal folosind o digerare pepsină limitată urmată de fracționarea diferențială de sare Colagenul de tip I a fost extras din pielea bovină fetală folosind o digerare pepsină limitată urmată de fracționarea diferențială a sării 55, Matricele colagenoase poroase de tip I și II au fost preparate așa cum s-a descris anterior Preparatele au fost apoi omogenizate pe gheață folosind un blender de mână Braun W.

Pentru a produce soluția de colagen-CS de tip II afibrilă 1: 1 în greutate0, 5 g de CS s-au dizolvat în acid acetic pH: 3, 2 și s-au adăugat picături în timpul omogenizării colagenului. Bulele de aer au fost îndepărtate prin degazarea vidului pentru a păstra omogenitatea suspensiilor. Monomerii dializați au fost apoi plasați într-un incubator la 37 ° C timp de 4 ore pentru a permite formarea gelurilor fibrilare. Suspensiile afibrilare și fibrilare reconstituite au fost apoi spălate și congelate ° C în matrițe cilindrice din plastic și uscate la congelat timp de 24 de ore.

Formulările de schele sunt rezumate în tabelul 1. Caracterizarea schelei Am caracterizat condrogeneza și regenerarea cartilajului 1af conform metodelor noastre descrise anterior 17 pentru comparație cu condițiile 2af, 2af-CS, 2rf și 2rf-CS. Diferențele în gradientul de difuzie termică care rezultă din montarea eșantionului în matrițe din plastic duc la un anumit grad de direcționalitate a porilor, creând o structură de pori anisotrope, cu orientarea anisotropiei în direcția transferului de căldură în matriță.

Prin urmare, dimensiunile porilor au fost calculate ca suprafață a elipselor Arezultând un după durerile articulare ale berii de circularitateunde L este circumferința elipsei.

Porozitatea a fost determinată prin gravimetrie, așa cum condrogeneza și regenerarea cartilajului descris anterior 57, și a fost determinată pe baza greutății și dimensiunilor schelei și a densității materialului solid. Semănarea in vitro a celulelor Schelele au fost sterilizate prin iradiere gamma la 25 kGy folosind un Gammacell Best Theratronics Ltd. MSC-uri umane obținute din măduva osoasă de grad clinic au fost generate din aspirațiile de măduvă osoasă BM colectate din creasta iliacă a donatorilor sănătoși.

Consimțământul informat a fost obținut în conformitate cu cerințele ICHTB și procedurile au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante. Pe scurt, s-au colectat 2 ml de aspirat BM într-un tub cu µl de heparină fără conservanți.

O sută de µl de mediu de cultură celulară care conține fie Utilizarea diferitelor densități celulare a fost necesară pentru optimizarea analizelor, dar au fost întotdeauna însoțite de controale adecvate.

Mediul a fost schimbat la fiecare zile. Plăcile au fost imaginate de un scaner HP imediat după plasarea în mediul de cultură a celulelor diametrul inițial, ecuația 1apoi după 1 și 28 de zile.

ImageJ a fost utilizat pentru a măsura diametrul schelei. S-a demonstrat că există o relație liniară între activitatea alamarBlue și numărul de celule așa cum s-a determinat cuantificarea ADN-ului 58 în celulele stem derivate din periosteum uman.

Pentru a determina cantitatea de CS eliberată de eșafodele în primele trei zile de cultură, s-au colectat medii și s-a determinat conținutul CS, de asemenea conform instrucțiunilor producătorului.

Celulele au fost imaginate folosind microscopul cu fluorescență inversă Zeiss Axiovert Zeiss, Germania cu camera microscopului color Carl Zeiss Axiocam.